Protocollo operativo


Metodologia e raccolta campioni
Per la raccolta dei campioni sono state utilizzate due differenti tipologie di contenitori, scelte in base al tipo di analisi da condurre sul composto e alle quantità richieste dal laboratorio. Nello specifico si sono svolte valutazioni microbiologichee chimiche, per le quali sono stati adoperati rispettivamente:

  • Per le valutazioni microbiologiche, contenitori in vetro, con tappo a vite e volume 500ml, confezionati singolarmente in busta sigillata e garantiti sterili a macchina, quindi non inquinati da batteri o microbi;
  • Per le valutazioni chimiche, contenitori in plastica, con tappo a vite e volume 150ml, non sterili e con specifica area di scrittura.
I contenitori sono stati completamente riempiti di campione, sigillati ed identificati mediante apposito cartellino descrittivo. Una volta confezionati, adeguatamente refrigerati, e conservati al riparo della luce per evitare modifiche chimico-fisiche alla matrice e alle sostanze presenti, i campioni sono stati consegnati al laboratorio A.R.P.A di Alessandria nell’arco della stessa giornata di prelievo.


Campionamento
Ai fini della corretta e accurata gestione dei campioni, sono state rispettate le seguenti operazioni di buona pratica di preparazione e manutenzione delle attrezzature utilizzate nel prelievo dei singoli substrati da analizzare: 
  • gli strumenti e le attrezzature impiegati nelle diverse operazioni sono costituiti da materiali e modalità il cui impiego non ha modificato le caratteristiche dei digestato oggetto di campionamento;
  • le operazioni di prelievo dei campioni sono state compiute evitando la diffusione di contaminazione nell’ambiente circostante (cross-contamination);
  • prima di operare il prelievo, è stata garantita la pulizia e la sterilità di strumenti ed attrezzature utilizzati.
Nel campionamento del digestato solido, per assicurare che i campioni da sottoporre ad analisi fossero rappresentativi del digestato stoccato in cumulo, l’omogeneizzazione del materiale da prelevare è stata eseguita sul campo con il metodo della quartatura.

Il campionamento ha previsto inizialmente il prelievo di un campione primario composto da numerose frazioni derivate dalla loro raccolta in maniera casuale dall’intero cumulo del digestato; successivamente sul campione primario si è proceduto all’operazione di quartatura consistente nella suddivisione della massa il più possibile uniformemente in 4 parti uguali, da cui sono stati prelevati e riuniti i quarti diametralmente opposti; si è ripetuta l’operazione un’ulteriore volta ottenendo gli ultimi due quarti che hanno costituito  la massa da cui è stato prelevato il campione finale da inviare ad analisi.
 

Il campionamento del digestato allo stato liquido è stato eseguito prelevando il campionedirettamente dalle vasche di stoccaggio del digestato, da punti appositamente attrezzati per il prelievo, riempiendo i vasetti di vetro in toto.




















Determinazione dei parametri microbiologici
I risultati delle analisi microbiologiche, relativi ai singoli impianti indagati, riguardano complessivamente 30 campioni, dei quali N° 19 di digestato liquido e N° 11 campioni di digestato solido.

La positività o negatività determinata, al fine delle analisi condotte, è dovuta alla presenza o meno dei diversi patogeni all’interno dei singoli campioni. Il numero dei campioni che al termine delle analisi sono risultati positivi, ovvero in cui vi si è confermata la presenza dei microrganismi patogeni è di 12, dei quali N° 9 di digestato “liquido” e N° 3 di digestato “solido” mentre il numero dei campioni risultati negativi, ovvero nel quale non vi è presenza di patogeni, è di 18, dei quali N° 10 di digestato “liquido” e N° 8 di digestato “solido”.
 
N° Campione Data
ispezione		 Salmonella spppres/ass Clostridi solf. Riduttori MPN/ml Escherichia coli UFC/100ml Solido/
Liquido		 Positività/
Negatività		 Data acquisizione risultati
01/MG/A-B 26/02/2015 Assente 0 < 1 Liquido Negativo 13/06/2015
02/MG/A-B 26/02/2015 Assente 0 < 1 Solido Negativo 13/06/2015
03/MG/A-B 02/03/2015 Assente 0 84000 Liquido Positivo 13/06/2015
04/MG/A-B 02/03/2015 Assente 0 14000 Liquido Positivo 13/06/2015
05/MG/A-B 02/03/2015 Assente 0 500 Liquido Positivo 13/06/2015
06/MG/A-B 02/03/2015 Assente 0 < 1 Liquido Negativo 13/06/2015
07/MG/A-B 02/03/2015 Assente 0 < 1 Liquido Negativo 13/06/2015
08/MG/A-B 03/03/2015 Assente 0 < 1 Liquido Negativo 13/06/2015
09/MG/A-B 03/03/2015 Assente 20 < 1 Liquido Positivo 13/06/2015
10/MG/A-B 04/03/2015 Assente 12 700 Liquido Positivo 13/06/2015
11/MG/A-B 04/03/2015 Assente 0 75000 Solido Positivo 13/06/2015
12/MG/A-B 18/03/2015 Assente 0 < 1 Liquido Negativo 13/06/2015
13/MG/A-B 18/03/2015 Assente 0 3700 Solido Positivo 13/06/2015
14/MG/A-B 18/03/2015 Assente 0 9000 Liquido Positivo 13/06/2015
15/MG/A-B 18/03/2015 Assente 0 1600 Solido Positivo 13/06/2015
16/MG/A-B 24/03/2015 Assente 0 < 1 Liquido Negativo 13/06/2015
17/MG/A-B 24/03/2015 Assente 0 < 1 Solido Negativo 13/06/2015
18/MG/A-B 24/03/2015 Assente 0 < 1 Liquido Negativo 13/06/2015
19/MG/A-B 24/03/2015 Assente 0 < 1 Solido Negativo 13/06/2015
20/MG/A-B 25/03/2015 Assente 0 2000 Liquido Positivo 13/06/2015
21/MG/A-B 25/03/2015 Assente 0 19000 Liquido Positivo 13/06/2015
22/MG/A-B 14/04/2015 Assente 0 < 1 Liquido Negativo 13/06/2015
23/MG/A-B 14/04/2015 Assente 0 < 1 Solido Negativo 13/06/2015
24/MG/A-B 14/04/2015 Assente 0 < 1 Liquido Negativo 13/06/2015
25/MG/A-B 14/04/2015 Assente 0 < 1 Solido Negativo 13/06/2015
26/MG/A-B 15/04/2015 Assente 0 < 1 Liquido Negativo 13/06/2015
27/MG/A-B 15/04/2015 Presente 0 < 1 Liquido Positivo 13/06/2015
28/MG/A-B 15/04/2015 Assente 0 < 1 Solido Negativo 13/06/2015
29/MG/A-B 15/04/2015 Assente 0 < 1 Solido Negativo 13/06/2015
30/MG/A-B 15/04/2015 Assente 0 < 1 Solido Negativo 13/06/2015

Determinazione dei parametri chimici
Per ciò che concerne le analisi chimiche, i risultati ottenuti evidenziano un valore medio di pH per i campioni positivi pari a 8.2, contro un valore medio per i negativi pari a 8.6. Entrambe le medie complessive dei valori di pHsono state ottenute escludendo il valore medio del campione n° 11/MG/A-B, a causa dell’anomalo riscontro di un livello pericolosamente basso di pH di circa 3.9, che se così fosse, inevitabilmente porterebbe ad una situazione di stallo della digestione anaerobicadell’impianto, con il conseguente bloccodell’intera catena produttiva e ad uningente danno economico dovuto alla mancata produzione di energia elettrica e ai costi conseguenti il rispristino delle condizioni ottimali di processo.
 
N° Campione Data
ispezione		 Unità
pH		 Solido/
Liquido		 Positività/
Negatività		 Data acquisizione risultati
01/MG/A-B 26/02/2015 7,9 Liquido Negativo 13/06/2015
02/MG/A-B 26/02/2015 9,4 Solido Negativo 13/06/2015
03/MG/A-B 02/03/2015 8,1 Liquido Positivo 13/06/2015
04/MG/A-B 02/03/2015 8,5 Liquido Positivo 13/06/2015
05/MG/A-B 02/03/2015 8,5 Liquido Positivo 13/06/2015
06/MG/A-B 02/03/2015 8,5 Liquido Negativo 13/06/2015
07/MG/A-B 02/03/2015 8,1 Liquido Negativo 13/06/2015
08/MG/A-B 03/03/2015 8.5 Liquido Negativo 13/06/2015
09/MG/A-B 03/03/2015 8,4 Liquido Positivo 13/06/2015
10/MG/A-B 04/03/2015 7,6 Liquido Positivo 13/06/2015
11/MG/A-B 04/03/2015 3,9 Solido Positivo 13/06/2015
12/MG/A-B 18/03/2015 7,9 Liquido Negativo 13/06/2015
13/MG/A-B 18/03/2015 9,3 Solido Positivo 13/06/2015
14/MG/A-B 18/03/2015 8 Liquido Positivo 13/06/2015
15/MG/A-B 18/03/2015 9,1 Solido Positivo 13/06/2015
16/MG/A-B 24/03/2015 7,9 Liquido Negativo 13/06/2015
17/MG/A-B 24/03/2015 8,9 Solido Negativo 13/06/2015
18/MG/A-B 24/03/2015 8,3 Liquido Negativo 13/06/2015
19/MG/A-B 24/03/2015 8,5 Solido Negativo 13/06/2015
20/MG/A-B 25/03/2015 7,7 Liquido Positivo 13/06/2015
21/MG/A-B 25/03/2015 7,4 Liquido Positivo 13/06/2015
22/MG/A-B 14/04/2015 8,7 Liquido Negativo 13/06/2015
23/MG/A-B 14/04/2015 9 Solido Negativo 13/06/2015
24/MG/A-B 14/04/2015 8,1 Liquido Negativo 13/06/2015
25/MG/A-B 14/04/2015 9,2 Solido Negativo 13/06/2015
26/MG/A-B 15/04/2015 8,1 Liquido Negativo 13/06/2015
27/MG/A-B 15/04/2015 8 Liquido Positivo 13/06/2015
28/MG/A-B 15/04/2015 8,9 Solido Negativo 13/06/2015
29/MG/A-B 15/04/2015 9,2 Solido Negativo 13/06/2015
30/MG/A-B 15/04/2015 8,9 Solido Negativo 13/06/2015


Valutazione statistica
 















La prevalenza della positività per almeno uno dei tre patogeni cercati si colloca intorno al 40% (tabella 1), tuttavia a causa della ridotta dimensione campionaria l’effettivo valore della prevalenza di positività ha una probabilità del 95% di essere compreso fra 24.6% e 57.7%.


 
 
L’analisi della possibile relazione fra positività (combinata) e valore medio del pH (tabella 2), non rivela come statisticamente significativa la differenza fra il pH medio dei negativi (pari a 8.6) e il pH medio dei positivi (pari a 7.9). La differenza è ascrivibile in massima parte al valore del campione [11/MG] (nel grafico 1 rappresentato da un cerchietto) che presenta un valore di pH=3.9 e una positività per escherichia coli, infatti escludendo dall’analisi questo valore, il valore medio di pH per i positivi risulta pari a 8.2 (mediana=8.1), contro il valor medio del pH per i negativi pH=8.6 (mediana=8.5) e questa differenza non risulta statisticamente significativa.











































La differenza fra il pH medio dei liquidi (pari a 8.1) e il pH medio dei solidi (pari a 8.6) (tabella 3), non si rivela come statisticamente significativa, bisogna osservare che i valori di pH rilevati su materiale solido sono molti più variabili dei valori di pH rilevati su materiale liquido (sd-liquido=0.35 vs sd-solido=1.6). Inoltre dobbiamo sottolineare che il valore di pH del campione [11/MG] pH=3.9 (nel grafico 2 rappresentato dal cerchietto) rilevato su materiale solido si mostra in “contro tendenza” rispetto al corpo dei valori di pH registrati su analogo materiale (solido); pertanto escludendo questo valore e ripetendo l’analisi, il valore medio di pH per i liquidi risulta, inalterato, pari ha 8.1 (mediana=8.1), contro il valor medio del pH per i solidi pH=9.0 (mediana=9.1) questa differenza risulta statisticamente significativa al livello del 5% (test di studentdf=27 t-test = -7.39  p<0.0001), osserviamo inoltre che la variabilità dei due gruppi ora risulta sovrapponibile (sd-liquidi=0.35  vs sd-solidi=0.26).
Riguardo la possibile relazione fra escherichia coli e tipo di materiale (solido liquido), non si evince nessuna differenza nel numero medio delle colonie isolate per tipo di materiale, o relazione fra presenza di E.coli e tipo di materiale (tabella 4) test del chi-quadrato=1.172 p-value=0.2789, inoltre non si evince relazione fra positività e tipo di materiale (tabella 5) test del chi-quadrato=0.2871 p-value=0.5921.